近日，浙江省農業(yè)科學院發(fā)表文獻，利用LUYOR-3415RG便攜式熒光蛋白激發(fā)光源對轉基因玉米雙抗的可視化檢測。文獻摘要如下：
轉基因玉米雙抗 12-5 具有良好的抗蟲性和除草劑耐受性，是我國批獲得安全證書的轉基因 玉米之一，具有廣闊的應用前景。本研究利用重組酶聚合酶擴增技術（recombinase polymerase amplification，RPA）建立轉基因玉米雙抗 12-5 的現(xiàn)場快速檢測方法。
針對轉基因玉米雙抗 12-5 的轉 化體特異性序列片段，設計引物和探針，通過引物篩選實驗得到更佳引物與探針組合。熒光 RPA 擴增 結果可以在藍光（LUYOR-3415RG）下直接進行可視化分析。結果表明，建立的轉基因玉米雙抗 12-5 可視化檢測體系特異 性強，檢測靈敏度達到 10 拷貝。進一步研究發(fā)現(xiàn) RPA 的擴增體系對溫度有很強的適應性，樣品在 34℃ ~46℃之間都能得到擴增，據此，本研究利用市面上常見的自發(fā)熱暖貼代替常規(guī)的加熱儀器來激發(fā) RPA。 結果表明，自發(fā)熱暖貼滿足 RPA 擴增體系對溫度的需要。
最終，本研究將自發(fā)熱暖貼加熱法與 RPA 可 視化檢測體系結合，對轉基因玉米雙抗 12-5 進行現(xiàn)場檢測，并與 qPCR 方法檢測結果作比較，檢測結果表明，本研究建立的現(xiàn)場可視化檢測方法與 qPCR 方法檢測結果一致，并且可視化檢測方法時間短， 檢測結果清晰易分辨。本研究建立的轉基因玉米雙抗 12-5 現(xiàn)場快速可視化檢測方法，其特異性強、靈敏度高、方便、快捷，不僅滿足了轉基因玉米雙抗 12-5的現(xiàn)場快速檢測的需要，也為其他現(xiàn)場快速檢測方法的開發(fā)提供了新思路。
1 材料與方法
1.1 材料 轉基因玉米雙抗 12-5 種子，轉基因玉米 NK603、BT176、T25 和 BT11，轉基因大豆 A5547-127、356043、GTS40-3-2 和 FG72，轉基因油菜 MS1×RF1、MS2×RF2、MS8×RF3 和 OXY235，轉基因棉花 LLcotton25、MON15985 和 GHB119 的 DNA 均來自本實驗室。
1.2 DNA 提取 按照植物 DNA 提取試劑盒（杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司）說明書提取各樣品的基 因組 DNA，所提取的 DNA 用核酸蛋白測定儀 NanoDrop2000C（美國 Thermo 公司）進行核 酸質量分析，并置于-20℃貯存?zhèn)溆谩?nbsp;
1.3 熒光 RPA 參照 RPA（熒光型）試劑盒（濰坊安普未來生物科技有限公司）說明書進行體系配置， 熒光 RPA 反應體系為 50 μL：Buffer A 12.5 μL，10 μmol/L 正、反向引物各 2 μL，10 μmol/L 探針 0.6 μL，模板 DNA 2 μL，加 ddH2O 補齊到 47.5 μL，充分混勻后加入 Buffer B 2.5 μL， 再次混勻。熒光 RPA 反應條件：39℃擴增 20 min。熒光 RPA 的實時熒光信號用熒光定量 PCR 儀 CFX96（美國伯樂公司）觀察，熒光 RPA 的可視化結果用手持藍光燈（LUYOR-3415RG，路陽儀器）照射并在黃色濾鏡下拍照觀察。
1.4 引物與探針設計 熒光 RPA 體系包括 2 條引物和 1 條探針，轉基因玉米雙抗 12-5 的載體示意圖及擴增的 轉化體特異性序列信息見圖 1A。利用 Vector NTI 軟件在外源插入位點的左側即轉基因玉米 基因組序列設計上游引物 8 條，在外源插入位點的右側即外源插入片段序列設計下游引物 8 條。所設計的上、下游引物分別處于外源插入位點的兩側，以保證對轉基因玉米雙抗 12-5 的 特異性擴增。引物長度 30~35 bp，GC 含量占 30%~70%[13]。所設計探針包含玉米基因組和 外源片段的序列，長度 46~52 bp，并避免回文序列、內部二級結構和連續(xù)重復堿基。探針共 有 4 個修飾位點，在距離 5'端中間部位，第 31 個堿基 G 處標記一個四氫呋喃（THF）堿基 類似物，作為核酸外切酶的識別位點；在 THF 位點的上游，第 30 個堿基 T 處標記一個熒光 基團（FAM:6-羧基熒光素），在 THF 位點的下游，第 33 個堿基 T 處標記一個淬滅基團（BHQ: 熒光猝滅基團），兩基團的間距為 1~5 bp；THF 位點距離 3'末端至少 15 bp 長度，并在 3'末 端標記一個修飾基團。只有當探針與序列成功配對時，THF 位點才會被外切酶切割，使熒光 基團與淬滅基團分離，從而產生熒光信號（圖 1B）。 轉基因玉米雙抗 12-5 的普通 PCR 引物和 qPCR 引物引用標準[14]，本研究所用的引 物和探針配制為 10 μmol/L。所有引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成， 引物和探針信息見表 1。
1.5 引物篩查 用上游引物 F1 分別與所有下游引物組合，結合探針，對轉基因玉米雙抗 12-5 進行實時 熒光 RPA 檢測實驗，分析結果，選出其中擴增效率更高的下游引物，再用這條下游引物分 別與所有上游引物組合，結合探針，對轉基因玉米雙抗 12-5 進行實時熒光 RPA 檢測實驗， 選擇擴增效率更高的一組，作為最終的檢測引物組合。
RRC平臺實樣現(xiàn)場檢測
為評估RRC平臺在真實樣品現(xiàn)場檢測中的適用性，以96顆大豆的96片葉片作為真實樣品。一個簡短的工作流程展示在圖 3A. 所有 DNA 均通過 RDEM 提取，并用作 RT-PCR 和 RAA 的模板。RRC平臺的視覺熒光結果表明，從96個樣品中檢測到22個SHZD32-1。帶有SHZD32-1的試管中呈現(xiàn)亮綠色熒光。因此很容易與其他沒有 SHZD32-1 的管區(qū)分開來（圖 1B）。此外，使用熒光成像系統(tǒng)（ChemiDoc Imaging System，Bio-Rad，美國）分析 RRC 平臺的 96 孔板。在這些管中觀察到白色熒光（圖 1B）。這一結果意味著手持熒光燈(LUYOR-3415RG)的可視化結果可以與大型專業(yè)儀器的觀察結果相媲美。此外，RRC平臺和RT-PCR的現(xiàn)場檢測結果一致。96份樣本經RT-PCR檢測，同樣22份樣本為SHZD32-1，22份樣本的Ct值與擴增曲線一起給出（圖 1C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，RRC 平臺對于目標核酸的現(xiàn)場檢測具有高度的準確性。
文獻全文下載地址：
Frontiers | A Fast, Visual, and Instrument-free Platform Involving Rapid DNA Extraction, Chemical Heating, and Recombinase Aided Amplification for On-Site Nucleic Acid Detection | Bioengineering and Biotechnology (frontiersin.org)
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